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臺式高速離心機(jī)DNA酶切及凝膠電泳
發(fā)布日期：2011-05-09 瀏覽次數(shù)：2422
一、DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析
限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）,它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個(gè)核苷酸序列:5''-G↓AATTC-3''）,有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段（如SmaⅠ:5''-CCC↓GGG-3''）;有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端,如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。
5''…G↓AATTC…3''→5''…GAATTC…3''
3''…CTTAA↑G…5''→3''…CTTAAG…5''
DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的zui適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在*個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。
DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是*的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。
構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和程度。
在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)zui適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和zui適反應(yīng)溫度（大多數(shù)為37℃）。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言,限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μgDNA加1單位酶,消化1-2小時(shí)。但要*酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長。
二、凝膠電泳
瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。
瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好,其分辯力*,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA的分子大小:
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。
2、瓊脂糖濃度
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA分子的構(gòu)象
當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動zui快,而線狀雙鏈DNA移動zui慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
4、電源電壓
在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到zui大,所加電壓不得超過5v/cm。
5、嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會使線狀DNA遷移率降低15％。
6、離子強(qiáng)度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠）,電導(dǎo)率zui小,DNA幾乎不移動,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液）,則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會引起凝膠熔化或DNA變性。
對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸],TBE（Tris-硼酸和EDTA）,TPE（Tris-磷酸和EDTA）,一般配制成濃縮母液,儲于室溫。
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